## 冻存原理

当细胞的温度低于0°C时，细胞会发生脱水现象，可溶性物质的浓度增加，并在细胞内部形成冰晶。不同大小的冰晶对细胞的影响显著不同，大冰晶容易导致细胞膜和细胞器的损伤与破裂，最终影响复苏后的细胞存活率和状态。因此，在进行细胞冻存时，我们通常采取两大措施：一是添加低温保护剂，二是实施慢冻过程。

## 冻存时机

细胞在生长状态良好时进行冻存为理想选择，细胞密度应达到80-90%，且细胞数量通常应在106-107/ml之间。活力差的细胞在冻存后的成活率较低，效果不佳。

## 低温保护剂

常用的低温保护剂为二甲基亚砜（DMSO），它作为一种渗透保护剂，可以迅速进入细胞，增强细胞膜对水的通透性，降低冰点并延缓冻结过程。这使得细胞内的水分在冻结前能够迅速排出细胞，外部形成冰晶，减少细胞内冰晶的生成，从而降低冰晶对细胞的损伤。

## 慢冻细胞

为避免细胞内部产生大冰晶，可以使用程序性降温设备缓慢冷冻细胞。未配备此设备时，可以将细胞依次放置于4°C 1小时、-20°C 2小时，最终在-80°C过夜，这样大部分细胞也能够适应冻存过程。

## 冻存液配置

冻存液需提前配置并放置于室温以备使用，避免临时配置时产生的热量对细胞造成损伤（如DMSO加到培养基中会放热）。常规冻存液的配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1。若细胞较为珍贵，则可调整为血清：DMSO=9:1。

## 操作步骤

1. 用移液器吸走原培养基，加入适量PBS，清洗1-2遍；

2. 消化细胞：加入适量的胰酶，并放入37°C培养箱中消化（在10厘米培养皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5分钟，需注意不同细胞消化时间不同，终止消化时通过显微镜观察80%-90%以上细胞呈圆形）；

3. 消化完成后，加入2倍体积的完全培养基以终止消化，随后以800-1000rpm离心3-5分钟；

4. 准备冻存管，并标记日期、细胞类别、负责人员姓名及代数，待细胞离心后去除上清，加入冻存液重新悬浮，每管1-1.5ml，转移至冻存管内；

5. 将冻存管放入程序降温盒中，置于-80°C过夜后，再转移至液氮中保存。

## 注意事项

1. 细胞加入冻存液后应立即存放于-80°C，避免常温下放置时间过长；

2. 在-80°C中保存冻存细胞通常不建议超过半年，而在液氮中保存的时间通常不应超过2年。

通过应用以上冻存技术，科学家们可以有效提升细胞的存活率，保障科研工作的顺利进行。尤其是在生物医疗领域，保持细胞状态的稳定是实现有效实验的关键，这正是尊龙凯时-人生就是博所倡导的一种科学精神。